Hayvanlarda Enterotoksemi Hastalığının Hızlı Teşhisi için Nörominidaz Tanı Kitlerinin Geliştirilmesi

PROJE ADI: Hayvanlarda Enterotoksemi Hastalığının Hızlı Teşhisi için Nörominidaz Tanı Kitlerinin Geliştirilmesi
PROJE YÜRÜTÜCÜSÜ: Prof. Dr. Özlem ÖZMEN
PROJENİN KONUSU:
Enterotoksemiler Clostridium perfringens’in değişik toksinleri sebebiyle şekillenen koyun, keçi ve sığırların hem yavru hem de erişkinleri başta olmak üzere birçok hayvanda ani ölümlerle sonuçlanan enfeksiyonlardır. Enterotoksemiler hayvanların bağırsaklarında mikroorganizmaların aşırı miktarda üremesiyle şekillenen ve genel bir toksemi ile karakterize olan önemli bir grup hastalıktır. C. perfringens doğada yaygın olarak bulunan anaerob özellikte bir bakteridir. Toprakta, tatlı ve kirli sularda, insan ve hayvanların sindirim sistemlerinde her zaman mevcuttur. Etkenler çeşitli predispoze faktörler ile birlikte hastalık oluşturmaktadır. Enterotoksemilerin A, B, C, D ve E olmak üzere 5 tipi bulunmaktadır. Her tip birden fazla toksin tarafından meydana getirmektedir. Yurdumuzda en çok Tip B, C ve D tipleri tespit edilmektedir. Enterotoksemiler major toksinlere göre tiplendirilmekte olup, klinik olarak hastalığın tiplendirilmesinden daha önemlisi hastalığın varlığının tespitidir. Çünkü hastalığın en etkili tedavisi aşılama ile yapılmaktadır. Bu nedenle hastalıkta hızlı teşhis hastalığın kontrolünde oldukça önemli bir husustur. C. perfringens’in neden olduğu ve genellikle ölümcül olan enterotoksemik hastalık tablolarının oluşumunda etkili 16 farklı virülens faktörü bulunmaktadır. Bunlardan 12 tanesi etkenin ürettiği toksinlerdir. Diğer önemli virülens faktörleri arasında enterotoksin, hemolizin, nöraminidaz (sialidaz) ve etkenin dinamik metabolik aktivitesi yer almaktadır.

Hastalık kontrolü için gerçekleştirilen enterotoksemi aşıları genellikle birçok tipe karşı polivalen aşılar şeklindedir. Bu sebeple tip tespiti hızlı teşhis için çok gerekli değildir, hayvanlar enterotoksemi teşhisi veya şüphesi durumlarında birçok tipe karşı aşılanmaktadırlar. Nöraminidaz tüm tiplerde bulunan bir enzim olup C. perfingens için spesifik nöraminidaz için yapılacak antiserum ile oluşturulacak kitler hızlı teşhis ve aşılama programları ile ekonomik kayıpları önemli ölçüde azaltılacaktır. Bu hastalıkta asıl amaç sağlıklı hayvanların aşılanarak hastalığa karşı bağışıklanmasıdır. Bu test ile ayrıca sağlıklı hayvanlarda bu enzimin bulunmadığı tespit edilerek de aşılama programlarının planlanması sağlanabilecektir. Yapılan incelemelerde nöraminidaz tespitine yönelik olarak yapılmış herhangi bir kite rastlanmamıştır.

Nöraminidaz bütün C. perfringens tipleri tarafından üretilebilen bir enzim olup sialidaz olarak da adlandırılmaktadır. Nöraminidaz, hücre yüzeyindeki reseptör moleküllerini veya bağ dokuyu yıkımlayarak etki göstermektedir. Bakterilerden salgılanan nöraminidaz, exo-α-silidaz olarak adlandırılan ve konakçıların hücrelerinde bulunan oligosakkaritler, glikoproteinler ve glikolipidler üzerinde bulunan terminal sialik asit kalıntılarının α-glikozidik bağlarını hidrolize eder. Sialik asit, çeşitli hücre-hücre etkileşimleri ve hücre-molekül tanıma süreçlerinde önemli bir rol oynar ve bakteriler için besin kaynağıdır. Bakteriler, sialik asidi iki yoldan elde edebilir bunlar yeni sentezleme veya konaktan toplama olarak sıralanabilir. Bakterilerden salgılanan nöraminidaz, farklı organizmalardaki sialoglikokonjugatların terminal sialik asitlerinin hidrolizini katalizler ve serbest sialik asit doğrudan bakteri zarına taşınır. Sialik asit daha sonra bakterilerin çoğalması için enerji ve karbon kaynağı olarak kullanılır. Ayrıca, nöraminidaz, bakteriyel enfeksiyonun ilk aşamalarında önemli bir rol oynar ve glikoprotein kaplı yüzeylerde biyofilm oluşumuna katkıda bulunur. Son zamanlarda yapılan bilimsel çalışmalar nöraminidaz inhibitörlerinin bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek amacıyla terapötik ajanların geliştirilmesi için de yeni bir hedef olarak kullanılabileceği vurgulanmaktadır. Nöraminidazlar, enfeksiyonların ilk aşamalarında önemli işlevler görür, bunlar bakteri çoğalması ve kolonizasyonunda önemli rollere sahiptirler. Bu çalışmada da çiftlik hayvanları için önemli ve yüksek mortaliteye sebep olan enterotoksemi hastalığının hızlı teşhisi için nöraminidaz hızlı tanı kitleri geliştirilerek bu önemli hastalığa hızlı müdahale edilmesi sağlanacaktır. Çünkü bu hastalığın klinik semptomları birçok hastalık ile karışabilmektedir. Ancak bu hastalıkta antibiyotik tedavisi değil aşılama yapılması gerekmektedir. Bu sebeple hızlı teşhis çiftlik hayvanlarında ölüm oranının azaltılması için çok önemlidir.

PROJENİN AMACI:
Hızlı testler ya da hızlı tanı kitleri, genellikle 20 dakikadan daha kısa sürede hızlı sonuçlar veren ve kullanımı kolay testlerdir. Çoğu standart testin aksine, hızlı testler laboratuvara gönderilmeden hemen hasta başında uygulanır ve sonuçları kısa süre içinde gösterir. Böylelikle teşhis için zaman kaybı önlenmiş olmakla kalmaz hızlıca tedaviye geçilmesi için de bilgi verir. Hızlı testler için kullanılacak materyal kan, idrar, gaita, salya veya burun salgısı gibi hastaya zarar vermeden toplanan örnekler olduğu için aynı zamanda pratik bir yöntemdir. Bakteri, virus, proteinler ve kimyasal maddeler gibi birçok madde hızlı test kitleri ile tespit edilebilir. Protein yapısındaki maddeler için antijen antikor reaksiyonu temelinde çalışan bu kitler hızla hekimlerin kullanım alanına girmektedir.

Benzer şekilde hayvan hastalıkları için üretilen tanı kitleri de Veteriner Hekimler için hastane ve saha koşullarında hızlı teşhis açısından oldukça yararlıdır. Saha koşullarında doğru teşhisi kısa sürede koyabilmek açısından kolay ve pratik olan bu testlerin kullanımı Veteriner hekimlikte hızla artmaktadır. Ancak tüm hastalıkların hızlı testlerinin bulunmaması ve bulunanlar için yurtdışına bağımlılık en önemli problemlerdir. Yurtdışı bağımlılığı bu kitlerin fiyatını da arttırmakta ve ekonomikliği önemli ölçüde azaltmaktadır. Çiftlik hayvanlarında bir hastalık teşhisi için kullanılan ithal bir kitin ortalama fiyatı 10 dolar civarındadır. Ayrıca özellikle viral etken teşhislerinde yerli suşlarla yurt dışındaki suşlar arasındaki farklar yanlış sonuçlara neden olabilmektedir. Tüm bu sebeplerle yerli ve milli kitlerin üretimi zorunludur.

Bu projede enterotoksemi hastalığı için tanı kiti üretimi için BALB/c fareleri nöraminidaz proteini ile bir adjuvant varlığında 3 – 4 kez immünize edilecek ve farelerde bu proteine karşı en yüksek antikor aktivitesine sahip hayvanlar füzyon çalışmasına tabi tutulacaktır. Farelerin dalak ve lenf düğümlerinden elde edilecek lenfositler in vitro koşullarda myeloma hücresi ile birleştirilerek, hücre kültür ortamında sürekli çoğalabilen ve aynı zamanda antikor sentezleyen hibrid hücreler oluşturulacaktır. Nöraminidaz proteinine spesifik antikor üreten hibrid hücreler ELISA testi kullanılarak belirlenecektir. Anti-nöraminidaz antikorunun elde edilmesinden sonra monoklonal antikorlar yine in vitro koşullarda geniş ölçekte üretilecek ve çeşitli protein saflaştırma kolonları kullanılarak saflaştırılacaktır. Saflaştırılan monoklonal antikorlar tanı kitlerinde kullanılmak üzere çeşitli enzimlerle işaretlenecek ve tanı kiti prototipi oluşturularak hasta hayvanlardan alınacak kan, gaita ve vücut sıvısı örneklerinde tanı kitinin çalışma hassaslığı ve beraberinde ürünün raf ömrünün belirlenmesi çalışmaları gerçekleştirilecektir.

Nöraminidazlar, bakteriyel patogenez sırasında doğrudan virülans faktörleri olarak işlev gösterirler. C. perfringens üç farklı nöraminidaz (sialidaz) üretir, bunlar NanH, NanI ve NanJ olarak adlandırılır. NanH (43 kDa), bir salgı sinyali peptidi içermez ve bu nedenle log-faz kültürlerde sitoplazmik bir konuma sahiptir. Buna karşılık, NanI (77 kDa) ve NanJ (129 kDa) salgılanan eksosialidazlardır. Üç sialidazın katalitik modülleri, korunmuş amino asit dizisi kimliği gösterir ve bu aile 33 karbonhidrat bağlama modülüne sahiptir. Sadece bir katalitik alanı içeren NanH'ye kıyasla, NanI ve NanJ ayrıca ek karbonhidrat bağlama modülleri de içerir. Bu karbonhidrat bağlama alanlarının, NanI ve NanJ ile çoklu değerli substratlar arasındaki bağlanma afiniteini artırdığı düşünülmektedir. NanJ, bir merkezi katalitik modül ve beş aksesuar modülden oluşan karmaşık çok modüllü bir yapıya sahiptir. İki N-terminal modül, aile 32 ve aile 40 CBM'ler ile amino asit dizisi kimliği gösterir. NanI ise katalitik modül ve bir N-terminal aile 40 CBM'den oluşan daha basit bir yapıya sahiptir. Ayrıca kimyasal yapı olarak NanJ’nin kimyasal yapısını da içerir.

Projenin şu ana kadar gerçekleştirilen aşamalarında ticari nöraminidaz satın alınarak yukarıda sıralanan tüm aşamalar gerçekleştirilmiş ancak satın alınan maddenin saflık derecesinin düşük olması sebebiyle sahada istenilen düzeyde doğruluk yakalanamamıştır. Bu sebeple nöraminidazın NanI olarak bilinen ve hastalık gelişiminde en önemli rolü oynayan bölümünün rekombinant olarak üretilmesi ve üretilecek bu protein üzerinden çalışmanın tekrarlanarak yüksek doğruluk veren kitlerin üretilmesi sağlanacaktır.

PROJENİN BÖLGESEL KATKISI:
Ruminantlarda enterotoksemi hayvanların gastrointestinal sistemlerinde ciddi sorunlara neden olabilen bir bakteriyel hastalıktır. Bu hastalık, özellikle koyun, keçi ve büyükbaş hayvanlarda daha yaygın olarak görülür. Enterotoksemi nedeniyle ölümler, birçok faktöre bağlı olarak değişkenlik gösterebilir. Ölüm oranları, hastalığın bulaşma derecesi, hayvanların bağışıklık sisteminin durumu, coğrafi konum, besleme uygulamaları ve tedaviye erişim gibi faktörlere bağlı olarak farklılık gösterebilir. Özellikle aşılama ve hastalığın erken teşhisi, tedavinin başarısı açısından önemlidir. Hastalıktaki bu faktörler ve hızlı teşhisin yapılıp yapılamamasına göre ölüm oranlarını önemli ölçüde değişebilir. Bu durum ise ekonomik kaybın çok büyük boyutlara çıkabileceğini göstermektedir.

Bu hastalıkta hayvanların çok kısa sürede ölebilmesi hastalığın doğru teşhisinde zamanın çok önemli olduğunu göstermektedir. Hastalığa her ne kadar C. perfringens’in toksinleri sebep olmakta ise de hastalık için patojenite faktörü sayılan nöraminidazın tespitinin teşhis açısından daha önemli olduğu düşünülmüş ve bu proje tasarlanmıştır.

Önerilen proje kapsamında nöraminidaz proteinini yüksek özgünlükte tanıyacak monoklonal antikor üretimi ve tanı kiti geliştirilmesi başarı ile tamamlandığı takdirde, üretilen kitler bu hastalığın teşhisinde oldukça pratik ve etkili bir ürün olacaktır. Üretimin ülke kaynakları ile yapılacak olması maliyeti önemli ölçüde düşürecek ve kullanımı arttıracaktır. Halen kullanılan az sayıdaki ithal ve pahalı Enterotoksemi ticari kitleri tiplere göre yapılmış karmaşık kitlerdir. Proje önerisinde geliştirilmesi planlanan hızlı tanı kitleri ile basit ve doğru teşhisin hızlı bir şekilde yapılması sağlanacak ve hem saha şartlarında hem de laboratuvar ortamında kullanılabilecek ELISA, strip, biyosensör ve immunohistokimya kitleri üretilmiş olacaktır. Bu çalışma ile özellikle ruminantlarda ciddi ekonomik kayıplara sebep olan enterotoksemilerin erken tespitini yapabilmek amacıyla canlı ve ölü hayvanlarda değişik şekillerde kullanılabilecek kitlerin üretilmesi hedeflenmektedir.

Bu proje çerçevesinde geliştirilecek hızlı testler ile sadece Veteriner Hekimlerin saha koşullarında kullanabilecekleri ve hastalığı hızlı teşhis kitleri üretilmekle kalmayacak aynı zamanda pratik ve ucuz kitler üretilecektir. Bu sayede hemen hemen tamamen yurt dışına bağlı olduğumuz bu kitlerin üretimi için bir alt yapı da oluşturulmuş olacaktır. Böylelikle bölgemizde yoğun şekilde yetiştirmesi yapılan büyük ve küçükbaş çiftlik hayvanlarının hastalıklarını hızla tespit edebilecek kitlerin yapıldığı bir merkezin de alt yapısı oluşturulmuş olacaktır. Bu durum ise bölgeye bilim adamları ve şirketlerin ilgisini arttıracaktır. Ayrıca bölge ekonomisinin büyük kısmını oluşturan çiftlik hayvanları yetiştirilmesi daha modern ve sağlıklı koşullarda yapılacak bu ise üretim kalitesini arttıracaktır. Kaliteli ve sağlıklı ürünlerin ekonomik değerinin yüksek olması ve sağlıklı hayvanlarda verimin yükselmesi gibi durumlar bölge hayvancılığı açısından artı bir değer olacaktır.

Bu proje ile antibiyotik tedavisinin etkili olmadığı enterotoksemi hastalığı hızlı ve doğru olarak teşhis edileceğinden gereksiz antibiyotik kullanımı da önlenmiş olacaktır. Bu durum ise gereksiz olarak kullanılan antibiyotiklerin sebep olacağı ekonomik kayıp ve antibiyotik kalıntılarını da önemli ölçüde azaltmış olacaktır. Antibiyotik direncinin gelişme ihtimali de ciddi şekilde düşecektir.  Ayrıca et ve sütte ilaç kalıntıları da şekillenmeyecek bu durum ise et veya sütün imhası ile oluşacak ekonomik kayıpları en aza indirilmiş olacaktır. Hem yavru hem de ergin hayvanlarda önemli kayıplara sebep olabilme ihtimali olan bu hastalığın hızlı ve doğru teşhisi hastalık etkeninin hem sürü içinde hem de çevrede azaltılması yönünden de önemli katkılar sağlayacaktır. Yukarıda sayılan tüm sebepler dolayısıyla enterotoksemi hastalığının saha koşullarında hızlı ve doğru teşhisinde kullanılabilecek yerli, milli, ucuz ve pratik kitlerin üretilmesi ve kullanılmasının önemi açıktır. Bu proje tüm bu sayılan kriterleri sağlayabilecek kapasiteye sahip olup başka hastalıkları için de teşhis kitleri üretilmesi için gereken alt yapıya ve deneyimli eleman yetiştirmeye önemli katkılar sunacak ve bölgemizi bir cazibe merkezi haline getirecektir.

PROJENİN TOPLUMSAL KATKISI:
Hayvan hastalıkları genel anlamı ile toplumsal açıdan önemi problemlerdir. Çünkü hayvan hastalıklarının bir dizi olumsuz etkiye neden olabileceği bilinmektedir. Enterotoksemi gibi birçok hastalık doğrudan hayvanlarda ölüme ve ekonomik kayba yol açmaları dışında gıda güvenliği açısından da önemli olabilmektedirler. Hayvan hastalıkları genel olarak hayvancılık ekonomisini olumsuz etkileyebilmekte ve ürün kayıplarına neden olabilmektedir. Özellikle enterotoksemi gibi hastalıklar hayvan popülasyonlarını azaltabilmekte ve bu da gıda üretimini de olumsuz olarak etkileyebilmektedir. Çiftlik hayvanlarının üretim amacı insanlarda gıda ihtiyacını karşılamaktır. Bu sebeple enterotoksemi gibi ölümcül hastalıkların tümü gıda üretimini olumsuz olarak etkilemektedir.

Genel olarak değerlendirildiğinde hastalıklar hayvan refahlarını da olumsuz olarak etkilemektedir. Hayvan refahı hem verim hem de gıda güvenliği açısından önemlidir. Dolayısıyla hastalıkların önlenmesi, eğer bu mümkün olmuyorsa hızlı teşhisi, hayvan refahı açısından da önemlidir. Bu nedenlerden dolayı hayvan hastalıklarının kontrolü ve önlenmesi, toplumun genel sağlığı, gıda güvenliği ve ekonomik istikrarı için büyük bir öneme sahiptir.

Ayrıca bu proje çerçevesinde monoklonal antikor üretimi, laboratuvar teknikleri ve kit üretimi gibi birçok konuda deneyimli eleman yetiştirilecek olması da projenin önemli bir artısıdır. Bu çalışmada elde edilecek veriler yayına dönüştürülecek ve bilime de katkıda bulunulacaktır.

Hızlı teşhis kitleri, hastalıkların erken aşamalarında tespit edilmesine olanak tanır. Erken teşhis, hastalığın doğru tedavisi ve tedaviye daha iyi yanıt vermesini sağlar. Hızlı teşhis, doğru tedavi yöntemlerinin belirlenmesine de yardımcı olur. Doğru tedavi, hastanın iyileşme şansını artırır ve yanlış tedaviden kaynaklanan komplikasyonları önler. Bu proje ile üretimi gerçekleştirilecek hızlı tanı kitleri Veteriner Hekimlere yönelik olup hızlı ve doğru enterotoksemi teşhisini saha veya hastane koşullarında koymayı sağlayacaktır. Böylelikle hastalığın prevalansı da daha net olarak belirlenmiş olacaktır. Çünkü bu hastalığın en önemli klinik semptomları olan ishal ve ani ölümler birçok hastalıkta görülebilmektedir. Ayrıca birçok vaka tam teşhis edilemeden hayvan ölümlerine sebep olduğu için hastalık prevalansı tam olarak tespit edilememektedir.

Enterotoksemi hastalığının hızlı teşhisi hem hayvanların hem de toplumun sağlığını korumak için büyük bir öneme sahiptir. Veteriner hekimler hastalığın hızlı ve doğru teşhisi için hızlı teşhis kitlerini kullanabilir ve tedavi ve korunma önlemleri alabilirler.

Bu çalışma ile ayrıca yurt dışına bağımlı olduğumuz teşhis kiti üretimi için önemli bir alt yapı oluşturulması gerçekleştirilmiş olacaktır. Bu durum Hayvancılık konusunda pilot üniversite olan üniversitemize bu misyonunu yerine getirmesi açısından da önemli bir destek verecektir.

Bu çalışma ile biyosensör, strip kit ve ELİSA kiti gibi değişik ürünler geliştirilecektir. Bu proje çerçevesinde dört ayrı patent başvurusu da yapılmış bulunmaktadır. Tüm bu hızlı teşhis kitleri hem bölge hem de ülke hayvancılığına ve hayvan refahına önemli bir katkı sağlayacaktır.

Bu proje ayrıca ileride yapılacak birçok proje ve kit üretimi için ekibin deneyim kazanması, yeni araştırıcıları yetişmesi ve belki de yeni tez projeleri yapılması için öncülük edecektir. Çünkü kit üretimi ülkemizde çok önemli bir sanayi kolu haline gelmektedir. Bu sebeple bu alanda yetişmiş insan kaynağı ve alt yapıya çok ihtiyaç vardır. Ayrıca bu üretim kolu birçok yan üretime ve dolayısıyla geniş bir sanayi alt yapısı oluşmasına yol açacaktır. Böylece bu proje hem Veteriner hekimlere hem hayvancılık sektörüne ve hem de akademik alana önemli katkılar verecek potansiyele sahiptir.

Dolayısıyla bu projenin toplumsal getirisi hem ülke ve hem de ülke hayvancılığı ve bilim camiasına önemli katkıları vermesi açısından oldukça önemlidir.